细胞计数

常用的计数方法

• 手工计数（如改良牛鲍计数板）
• 细胞计数仪计数（经费充裕的课题组常备）
• 流式细胞仪计数

细胞计数板结构

改良牛鲍计数板

• “H”形凹槽，分为2个同样的计数池
• 计数池两侧各有一条支持柱，将特制的专用盖玻片覆盖其上，形成高0.10mm的计数池。
• 计数池内划有长、宽各3.0mm的方格，分9个大格。
• 每个大格面积为1.0毫米X1.0毫米=1.0平方毫米；容积为1.0平方毫米X0.1毫米=0.1立方毫米。
• 在进行细胞计数时，主要计数四角的4个大方格的区域，用单线划分为16 个中方格。

计数板处理

• 用无水乙醇（或 95%）擦拭计数板，取一张干净盖玻片覆在计数板上。

制备细胞悬液

• 加入0.25％胰蛋白酶－0.02％EDTA混合消化液1mL，静置3~5分钟，待见到细胞变圆，彼此不连接为止，轻轻进行吹打，制成细胞悬液。
• 稀释至合适倍数。如果细胞数量较多的情况下，可取一滴（或100μl）细胞混悬液＋八滴（或800ul）细胞培养液＋一滴（或100μl）苔盼蓝，这样最终稀释倍数为十倍。

染色

• 吸取 0.4% 台盼蓝染液，按 1∶1 比例，从计数板边缘缓缓滴入，使之充满计数板和盖片空隙。如有气泡则要重做。将计数板放在低倍镜下（10 × 10 倍）观察计数。

充池

• 将细胞计数板擦拭干净，吸取10ul细胞混悬液滴加至计数池边缘，液滴通过虹吸作用进入盖玻片下方，将计数板静置5分钟左右。

计数

• 在低倍镜（10×10倍）下，观察充池的细胞分布是否均匀，若充池不均匀则需重新充池。随后计数四个大方格中的细胞

计数原则

• 数上不数下，数左不数右

• 只计数完整的细胞，聚成一团的细胞则按一个进行计数

计算换算

• 计数后，需换算出每 ml 悬液中的细胞数。由于计数板中每一方格的面积为 0.01 cm²，高为 0.01 cm，这样它的体积为 0.1 mm³。由于 1 ml = 1,000 mm³，故每一大方格内细胞数 × 10,000 = 细胞数/ml

没有使用台盼兰染色

• 细胞悬液细胞数/mL=(N总/4)×10^4×稀释倍数

使用台盼兰染色，需计算活细胞的百分率：

• 活细胞百分率(%)=台盼兰拒染细胞数/总细胞数×100%

活细胞数的计算公式：

• 细胞悬液活细胞数/mL=(N总/4)×活细胞比率×10^4×稀释倍数×2

计数板和盖玻片用75%酒精擦干净并晾干。

充池时，建议使用10ul枪头

需要注意充池的手法，要干净利落

• 不能过重地加液，否则会导致细胞充池不均匀
• 也不能过轻，否则容易充不进去或者产生气泡
• 亦不能用枪头挑盖玻片，否则也容易充池不均，产生较大计数误差
• 加量适当，过多易使盖片漂移，或淹过盖片则需重做

计数的最适浓度为5～10×10^5细胞/ml

• 若细胞悬液浓度过高，则需要合理稀释
• 若细胞浓度过低，则需要离心后取合适培养液重悬。
• 只计数完整的活细胞，染成蓝色或折光性较弱的细胞均不能计数，聚成一团则按照一个细胞计数，两次重复计数误差通常不大于5%。
  

计算时明确需要进行实验的细胞数

• 可以通过提前设定所需细胞数量，计算得出细胞密度之后，加入相应体积的细胞悬液
• 应用举例：在铺24孔板时，若每孔需要1.0×10^5个细胞，24孔则需要2.4×10^6个细胞，通常会多计算一个孔的细胞数，则总共需要2.5×10^6个细胞。若稀释10倍之后，进行细胞计数后，N总为100个（此为细胞计数的四个大方格总数），则需要1ml该细胞悬液进行铺板（注意，最后会剩余1个孔的细胞量，所以会有细胞悬液残余），即N=C×V，此处N为所需细胞总数，C为细胞悬液密度，V为细胞悬液体积。

在细胞计数过程中充分混匀细胞悬液

• 细胞不宜在室温太久，吹打次数过多也会损伤细胞，导致细胞状态不好。
• 若方格中细胞分布明显不均，说明细胞悬液混合不均匀，需重新将细胞悬液进行混合，再计数

二次重复计数误差不应超过 ±5%