背景知识

克隆形成实验是研究细胞增殖能力和存活率的有效方法之一。贴壁后的细胞不一定每个都能增殖和形成克隆，而形成克隆的细胞必为贴壁和有增殖活力的细胞。

通过观察单个细胞在体外培养环境下的增殖和克隆形成情况，可以评估细胞的增殖能力和群体依赖性。

该实验包括平板克隆形成实验和软琼脂克隆形成实验，分别适用于不同类型的细胞。

 

基础理论知识

克隆形成

克隆形成是指单个细胞在体外持续分裂繁殖超过6代后，其后代组成的细胞群。光镜下，大于50个细胞，计数为1克隆。，大小在0.3-1.0 mm之间。

克隆形成率是指接种细胞后，成活并形成克隆的细胞数占总接种细胞数的百分比。反映细胞群体依赖性和增殖能力两个重要性状。

增殖能力

细胞增殖能力是指细胞在适宜条件下进行有丝分裂的能力。通过计算克隆形成率，可以评估细胞的增殖能力。

 群体依赖性

群体依赖性指的是细胞是否需要相互作用才能形成克隆。克隆形成率也能反映细胞的独立生存能力和群体依赖性。

应用范围

- 评估细胞增殖能力

- 研究细胞群体依赖性

- 筛选药物和治疗方案的有效性

- 评估细胞在体内形成肿瘤的潜力：癌细胞不一定都可以在体内成瘤，但若体外克隆能力越强，即表明体内成瘤性越强，算是模拟体内成瘤的体外实验。

 

基本原理

平板克隆形成实验（Colony Formation on Solid Media）

适用于贴壁生长的细胞，通过计数克隆数来评估细胞的增殖能力和群体依赖性。

 软琼脂克隆形成实验（Soft Agar Colony Formation）

适用于悬浮生长的细胞和肿瘤细胞，通过在琼脂中形成克隆来评估细胞的增殖能力和恶性程度。正常细胞依靠细胞与细胞外基质的接触才能生长和分裂，相反，不管周围环境如何，转化细胞均具有生长和分化的能力，因此能够以锚定独立的方式形成菌落的细胞被认为是转化和致癌的。这种方法的总体目标是以半定量和严格的方式测定细胞的这种能力。

设备耗材

  平板克隆形成实验

- 0.25% 胰酶溶液

- 含10% 胎牛血清的培养基

- PBS 溶液

- 4% 多聚甲醛溶液

- 结晶紫染液或姬姆萨染液：结晶紫是碱性染料，可以与核酸结合把细胞核染成蓝色，便于观察及计数

- 6孔板

软琼脂克隆形成实验

- 0.25% 胰酶溶液

- 含10% 胎牛血清的培养基

- PBS 溶液

- 超纯水

- 低熔点琼脂糖

- 2×完全培养基

- 6孔板

实验准备

  平板克隆形成实验

染液配方

- 10×Giemsa染色液：Giemsa粉末0.8g 溶于50mL甲醇，完全溶解后加入50mL甘油，摇匀，37℃-40℃水浴8-12h，棕色瓶常温保存，用时取1份Giemsa原液溶于9份PBS中。

- 0.1% 结晶紫染色液：称取1g结晶紫粉末，用甲醇定容到100mL，避光常温保存。

软琼脂克隆形成实验

- 配制1.2% 和0.7%琼脂糖溶液，高压灭菌，维持在40℃防止凝固。

操作步骤

 平板克隆形成实验

 制备细胞悬液

   - 将对数生长期的单层细胞常规消化离心收集细胞沉淀，重悬细胞沉淀，计数，稀释至1×10³个/mL。

 接种细胞

   - 以每孔50、100、200个细胞的梯度密度接种六孔板中，补加3mL培养基，置于37℃,5% CO₂培养箱中培养，静置培养2-3周。经常观察，当培养皿中出现肉眼可见的克隆时，终止培养

染色

   - 当培养皿中出现肉眼可见的克隆时，停止培养，弃掉培养基，用PBS小心洗涤2-3次，弃掉PBS。每孔加入4%多聚甲醛1mL，固定15min，弃固定液。PBS洗涤。每孔加入1mL 0.1%结晶紫或Giemsa染色液染色10-30min，流水缓慢洗去染液，空气干燥。

计数

   - 显微镜下计数含50个细胞以上的克隆数并拍照，取3个复孔的克隆平均值进行计算。

   - 克隆形成率 =（克隆数 / 接种细胞数）× 100%

结果展示

图片来源网络，侵删

软琼脂克隆形成实验

图片来源网络，侵删

 制备细胞悬液

   - 将对数生长期的单层细胞常规消化离心收集细胞沉淀，重悬细胞沉淀，计数，稀释至1×10³个/mL。

配置琼脂

   - 用蒸馏水分别制备出1.2%和0.7%两个浓度的低熔点琼脂糖溶液，高压灭菌后，维持在40℃防止凝固。

   - 铺下胶：按1:1比例混合1.2%琼脂糖和2×完全培养基（含2×抗生素和20%胎牛血清），取1.5mL加入6孔板中，冷却凝固，作底层琼脂置于培养箱中备用。作为支撑防止细胞贴附生长。

 接种细胞

   - 铺上胶：按1:1比例混合0.7%琼脂糖和2×完全培养基，再向混合液中加入0.2mL细胞悬液，充分混匀，注入铺有1.2%琼脂糖底层的孔板中，形成双琼脂层。最后加一层培养基以防干燥并补充营养。上层胶细胞数目根据不同的细胞类型而定。通常，使用5000个细胞/孔作为起始浓度，但可以根据需要进行调整。作为营养补充剂以及为防止下层琼脂胶干燥。

 培养

   - 室温静置30 min，待上层琼脂凝固后，置于培养箱中培养2-3周。

 观察与计数

   - 以肉眼可见的细胞团作为计数集落的标准，计算集落形成率。

 

Image J软件计数方法：

• 点击File→Open→打开图片。（也可将图片直接拖动到菜单栏，即可打开。）
• 将图像转为8-bit
  • 点击Image→Type→8-bit，此时图片即已被去色。

• 调整阈值，去除背景，选中细胞

点击Image→Adjust→Threshold对阈值进行调整，主要是为了选择细胞区域；

选择B&W（Black and White），图像中黑色的区域就是已经选中的区域。（这里可以进行更改，如若改为red，则红色区域为选中的区域。）

另外我们发现Threshold窗口中有两个调节框，我们可以通过左右拖动调节框中的滑块对选择的区域进行调整。原则是尽可能的包含所有的细胞同时去除背景中的杂质。

拖动完成后点击Apply，这样阈值就设置好了。

• 若出现细胞重叠或者贴近的情况，软件识别时将两个粘连在一起的细胞识别为一个，这时可以利用Watershed自动识别重叠部分，随后再将两个细胞分离开来。

点击Process→Binary→Watershed，这样粘连的细胞会被分开。

• 计数颗粒

点击Analyze→Analyze Particles，出现Analyze Particles界面，根据处理图像的不同，设置不同的参数。

Size：0.05-Infinity——指分析颗粒尺寸大于0.05

Circularity：0.00-1.00——指圆度，可以根据细胞形状，调整需要的圆度，1.00为标准圆，一般情况下只根据Size进行限制就可以了。

Show：Overlay——指原本图片上会展示出分析结果的外框。

Exclude on edges：——处于边缘的颗粒不计入。

 

注意事项

• 缓冲液清洗和固定时沿着孔板侧壁加入，不要吹掉细胞。
• 细胞悬液中单个分散细胞应多于90%，平板培养早期尽不要晃动培养皿，以晚细胞脱落，导致实验误差增加。
• 染色前固定液要吸干净，避免局部残留固定液将染剂稀释造成染色不均一。
• 染色完成后，务必将染液清洗干净，不要在孔中有残留。

 

平板克隆形成实验

- 细胞成团：制备单细胞悬液时需充分吹打分散细胞。

- 接种密度过高：会导致多个克隆融合，影响计数结果。需预实验确定最佳接种密度。

- 染色不均匀：染色液要充分覆盖细胞，染色时间控制适当。

- 培养基更换：定期观察培养基的颜色及污染情况，必要时更换。

 软琼脂克隆形成实验

- 琼脂温度：琼脂与培养基混合时温度不宜超过40℃，以免烫死细胞。

- 操作速度：操作过程中需迅速，以防局部结块。

- 细胞密度：上层琼脂中的细胞密度需根据细胞类型调整，一般以每孔200个细胞为宜。

- 琼脂毒性：琼脂经灭菌后应分装备用，反复加热易导致琼脂降解而产生毒性，且其硬度也会有所下降，因此高压灭菌后应进行分装。

只谈经验

拍照时，务必使每个孔中无阴影，如无法达到，则逐个孔进行拍照。

细胞计数时建议多计数几次。

平板克隆形成实验

- 均匀接种：确保细胞接种均匀是实验成功的关键。

- 减少扰动：培养过程中不要频繁移动培养皿，以免细胞脱落。

- 适量染色：染色时注意时间和染色液的用量，确保染色均匀。

软琼脂克隆形成实验

- 温度控制：琼脂与细胞混合时温度要适中，操作要快，避免局部结块。

- 凝固后操作：确保上下层琼脂完全凝固后再进行下一步操作。

- 合适密度：选择合适的细胞密度，确保结果准确。

 

常见问题

细胞未形成克隆：并非每种细胞都可以形成克隆，克隆形成率与细胞本身增殖能力有关。还与接种细胞密度，加入培养液的体积、血清浓度有关。因该实验处理时间较长，应给细胞多加培养基，如每孔4ml，或者3天更换一次培养基，以供给细胞充足的营养。

  平板克隆形成实验

1. 细胞成团：制备单细胞悬液时需充分吹打分散细胞。
2. 接种密度过高：会导致多个克隆融合，影响计数结果。需预实验确定最佳接种密度。
3. 染色不均匀：染色液要充分覆盖细胞，染色时间控制适当。

 软琼脂克隆形成实验

1. 琼脂温度过高或过低：过高会烫死细胞，过低会导致局部结块。琼脂与培养基混合时温度不宜超过40℃。
2. 细胞密度不合适：细胞密度过高或过低都会影响结果，需根据细胞类型调整密度。
3. 操作速度慢：操作过程中需迅速，以防琼脂局部凝固。

软琼脂克隆形成失败的原因：细胞自身的因素，半固体环境要求细胞恶性程度高，容易生长，恶性程度低且依赖贴壁生长的细胞可能不适用于此法。

通过以上详细步骤和注意事项，可以有效地进行克隆形成实验，从而评估细胞的增殖能力和群体依赖性。

参考文献：

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