细胞划痕实验

细胞划痕实验教程

全称别称

细胞划痕实验（Cell scratch assay），又称伤口愈合实验（Wound healing assay），是一种用于研究细胞迁移能力的体外实验方法。

背景知识

细胞迁移在胚胎发育、组织再生、免疫应答、伤口愈合和癌症转移等生理和病理过程中发挥着至关重要的作用。研究细胞迁移机制对理解这些过程以及开发新型治疗方法具有重要意义。

基础理论知识

细胞划痕实验通过在细胞单层上制造一个空白区域（划痕/伤痕），观察细胞如何迁移填补这一空白，从而评估细胞的迁移能力及其对不同处理条件的响应。这种方法可以模拟体内伤口愈合的过程，并用于研究细胞的生长、修复和相互作用。

应用范围

• 研究细胞迁移能力
• 观察药物、基因等外源因素对细胞迁移和修复的影响
• 研究肿瘤细胞的侵袭转移能力
• 评估细胞与胞外基质（ECM）、细胞与细胞之间的相互作用

优缺点

优点：

基本原理

在融合的单层细胞上人为制造一个空白区域（划痕/伤口），划痕边缘的细胞会逐渐进入空白区域使划痕愈合。通过测量不同时间点的划痕间距并计算差值，可以对细胞的迁移能力做出判断。

设备耗材

• 细胞培养板（6孔板）
• 显微镜（带摄像头）
• 划痕工具（200 µl枪头或细针）
• 移液器和无菌吸头
• PBS（磷酸盐缓冲盐水）
• 胰蛋白酶
• 培养基（DMEM或RPMI-1640，加入10%胎牛血清）
• 无血清培养基
• 马克笔、直尺

实验准备

1. 材料准备：确保所有耗材和设备齐全且经过消毒状态良好。
2. 细胞培养：选择合适的细胞线，使用特定培养基，在37°C、5% CO₂条件下培养。实验前一天将细胞传至新的培养板中，确保形成理想的单层细胞。
3. 预处理：实验前24小时去除血清，使细胞处于静止状态，检查细胞健康无污染，处于对数生长期。

操作步骤

单层划痕细胞制备

• 细胞消化：使用胰蛋白酶将准备用于划痕实验的细胞进行消化，离心-完全培养基重悬-细胞计数。
• 种植细胞：

划线：

• 在6孔板底面，用直尺和马克笔绘制平行线，间隔0.5-1 cm，每孔至少画5条水平线。

• 注意线不要太粗。

细胞种植：

• 将处于对数生长期的细胞消化成单细胞悬液，每孔接种约5×10⁵个细胞（以6孔板为例，每孔长满细胞，数量大概是1.2 × 10^6，建议种植50-70%细胞。），过夜培养，确保细胞形成完整的单层，融合率达到100%。【当细胞在皿底（30 mm 或6 well）融合率达到90%左右（不建议 100% 汇合，因为许多锚定依赖性细胞会经历接触抑制，这可能会改变它们的迁移能力。低于80%也不行，它导致照片无法使用，因为采集的图像划痕起伏/弯曲太大，不利于实验数据采集）来自GBhouse帖子】

划痕制作：

• 用直尺比着，用200 µl枪头垂直于孔板底面的横线划痕，使划痕与标记线相交。
• 确保枪头垂直，不倾斜，不同孔之间最好使用同一枪头，保持划痕宽度一致。
• 可以使用ibidi划痕插件创建间隙避免人工划痕

清洗和处理：

• 划痕完成后，用PBS缓慢冲洗细胞3次，去除划下的细胞，使留下的间隙清晰可见。
• 用PBS缓冲液冲洗时，注意贴壁慢慢加入，以免冲散单层贴壁细胞；反复多次冲洗，尽量洗掉所有的细胞碎片，否则会影响拍照效果。
• 然后加入新鲜的无血清培养基。如果细胞对无血清不耐受，可少加点血清以维持细胞状态。
• 划痕缩小是细胞迁移和细胞繁殖共同作用的结果，可用丝裂霉素（1 μg/ml）处理1小时抑制细胞分裂，单纯评估细胞迁移。

培养与观察：

• 将培养板置于37°C、5% CO₂培养箱中。按0、6、12、24、48小时的时间点取出细胞观察并拍照。
• 以预先做好的标记为定点观测点来进行定时拍照。
• 选择处理/对照组迁移能力差异明显的时间点拍照，拍摄与0h拍照时的相同位置，放大倍数相同。拍照时标记线不要出现在视野内，而是刚好沿着标记线的边拍照。细胞生长具有边缘效应，所以边缘细胞生长状态可能与中间的细胞不太一样，不宜作为观测点。
• 染色和观察：可选进行细胞染色，如使用Crystal Violet染色，以可视化细胞在划痕区域的迁移情况。

图像采集、数据分析：

• 使用 Image J 软件打开图片后，随机划取 6-8 条水平线，计算细胞间距离的均值。
• 使用ImageJ软件分析划痕面积的变化，计算伤口愈合率：
  伤口愈合率 (%) = [(0 h划痕面积 - 24 h划痕面积) / 0 h划痕面积] × 100%

• 使用ImageJ软件测量细胞迁移距离，以P值小于0.05为结果具有显著性，使用GraphPad Prism 软件绘制统计图。
• 细胞迁移距离：每个时间点的距离-0 h距离=每个时间长度细胞整体迁移的距离，求出均数和标准差。以时间（h）为横轴，迁移距离为纵轴（单位mm）作图，并比较初始 0 h与实验结束时实验组与对照组的照片。
• 计算划痕面积：面积检测方法（划痕距离测量为等效测量）；划痕宽度平均值 = 划痕空隙面积/长度；细胞迁移率 =（0 h 划痕宽度-培养后划痕宽度）/ 0 h 划痕宽度×100%
• 划痕面积和划痕宽度参见酸菜知乎贴：如何用ImageJ进行划痕实验宽度分析？ - 知乎 (zhihu.com)或科研不杂烩：https://mp.weixin.qq.com/s/GFB_gxlrIFr_tPBU099NvA

注意事项

1. 工具消毒：使用紫外线彻底消毒所有接触细胞的工具，如直尺和马克笔，避免细菌污染。
2. 细胞接种密度调整：根据细胞的生长速率调整接种数量，确保每个培养孔的细胞密度一致，均匀分布。
3. 保持划痕一致性：使用标准化工具和一致的操作方法制作划痕，确保每次实验中划痕的宽度和深度一致。
4. 轻柔冲洗：使用PBS缓慢冲洗细胞，避免对细胞层造成破坏。
5. 控制细胞增殖：使用无血清或低血清培养基，或用丝裂霉素抑制细胞分裂，减少增殖对实验结果的影响。
6. 固定观察点：按标记线的位置划痕，确保观察和拍照时位置固定。
7. 胰蛋白酶会影响细胞表面受体，进而影响细胞迁移，建议控制好时间
8. 拍照注意事项，使用低倍物镜（10X）确定划痕图像采集位置；保持划痕完全水平并位于视野的中心，获取尽可能多的图像以涵盖划痕长度的 90%，尽量不要包含划痕两端的5%。
9. 图像采集时间，一般是建议0h、6h、12h、24h、36h、48h、60h、72h采集图像数据，更能够较准确的反应细胞的迁移情况，同时也增加数据量。
10. 为了保证细胞爬过去而不是因为细胞增殖被挤过去的，需要用丝裂霉素处理，让细胞停止增殖；或划出划痕后，把培养基换成无血清的培养基（有的细胞对无血清不耐受，可以少加点血清，维持细胞的状态） ，细胞在无血清的环境中生长极其缓慢，可以认为细胞不增殖。
11. 虽然无血清培养可以忽略细胞增殖的影响，但是由于细胞内信号传导系统整体性的下调节，细胞迁移的速度也会慢很多。
12. 划痕法测量适用的细胞范围较小，一般只适用于上皮细胞，纤维样细胞。
13. 细胞类型特性：不同细胞类型迁移能力不同，实验条件需根据细胞特性进行优化。
14. 避免边缘效应：在分析时，注意排除由于培养板边缘造成的迁移偏差。
15. 在记录伤口愈合图像时，应持续至伤口缝隙大致减半闭合的状态。在多数案例中，无需持续记录直至伤口完全闭合

只谈经验

1. 在划痕时要稳定用力，确保创伤宽度一致性。
2. 在拍照时要确保位置固定，避免位置偏移影响结果准确性。
3. 根据细胞特性选择合适的培养基，以降低增殖对实验结果的影响。
4. 数据分析中，考虑多条迁移距离的平均值来代表实验结果的准确性。
5. 提前画好标记线，以确保划痕和观察位置的一致性。
6. 图像保存，采集好的图像必须根据分组和采集时间进行命名，以防时间久了忘记，导致后续不必要的麻烦。
7. 每次拍照前、后，尽量换掉培养基，去除飘落的细胞，能得到较为干净的划痕区域。
8. 枪头要垂直，不要倾斜。尽量保证各个划痕宽度一致：不同孔之间最好使用同一只枪头，最好保持力度一致，尽量一次性划完。

常见问题

1. 细胞不迁移：可能是细胞状态不好或选择的细胞类型不适合划痕实验。需要检查细胞的健康状况，并选择合适的细胞类型。
2. 划痕不均匀：划痕时用力不均或工具选择不当。确保使用标准化工具和一致的操作方法。
3. 细胞增殖影响实验结果：使用无血清或低血清培养基，或用丝裂霉素抑制细胞分裂。
4. 拍照位置不一致：使用标记线确保每次拍照的位置固定。
5. 不适宜划痕的细胞类型：生长特别缓慢的细胞（如：内皮细胞）、贴壁不牢的细胞（如：神经母细胞瘤）、堆积生长或长不满的细胞（如：巨噬细胞）

参考文献

1. W.J. Ashby, A. Zijlstra. Established and novel methods of interrogating two-dimensional cell migration. Integr Biol 2012, 10.1039/c2ib20154b
2. H. Wu, G. Xiao, X. He, J. Ju, J. Zhang, G. Sathishkumar, L. Yu, K. Zhang, X. Rao, Z. Lu, E.-T. Kang, L. Xu. A Wound Exudate-Activated Yarn Battery for Antimicrobial Electrical Fabric Dressing. Adv. Funct. Mater. 2024, 2405114.
3. Zhong, D.; Zuo, Y.; Shi, Y.; Zhang, P.; Xu, Y. and Li, B., Right once for all: Zinc-modulated highly stable iron-based ROS generator under physiological conditions for promoting bacteria-infected wound healing, Chem. Eng. J., 2023, 460, 141837.
4. Jung, S. H.; Jang, B. H.; Kwon, S.; Park, S. J.; Park, T. E. and Kang, J. H., Nematic Fibrin Fibers Enabling Vascularized Thrombus Implants Facilitate Scarless Cutaneous Wound Healing, Adv. Mater., 2023, 35, e2211149.
5. Peglion, F.; Capuana, L.; Perfettini, I. et al., PTEN inhibits AMPK to control collective migration, Nat Commun. 2022, 13, 4528.
6. Wei, C.; You, C.; Zhou, L.; Liu, H.; Zhou, S.; Wang, X.; Guo, R., Antimicrobial hydrogel microneedle loading verteporfin promotes skin regeneration by blocking mechanotransduction signaling, Chem. Eng. J., 2023, 472, 144866.